單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,臨床分子診斷與個體化治療,分子診斷,狹義分子診斷：,應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷，包括腫瘤分子診斷、傳染病分子診斷、產(chǎn)前診斷等。,廣義分子診斷：,指應(yīng)用分子生物學(xué)方法，對受檢者體內(nèi)各類生物分子（包括,DNA,、,RNA,、蛋白質(zhì)等）進(jìn)行定性和定量分析，確定其結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平，從而為個性化預(yù)防、治療提供依據(jù)的一種診斷技術(shù)，包括腫瘤分子診斷、傳染病分子診斷、產(chǎn)前診斷、單基因診斷、易感基因檢測以及天賦基因檢測等。,PCR,國內(nèi)回顧,1990,年,:PCR,技術(shù)在國內(nèi)開始用于臨床檢測,90,年代中期,:,假陰性,?/,假陽性,?,引發(fā)思考,1996,年,:,衛(wèi)生部科研課題,1998,年,3,月,20,日,:,臨床,PCR,實(shí)驗(yàn)室管理專家咨詢會,1998,年,4,月,16,日,:,衛(wèi)生部下發(fā),國內(nèi)回顧,2,1999,年,4,月,29-30,日,:,針對臨床開展,PCR,檢驗(yàn)的問題,達(dá)成八點(diǎn)意見,.,1999,年,8,月,17-24,日,:(,在北京衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心舉辦,.,2002,年,1,月,14,日,:,衛(wèi)生部下發(fā),(,衛(wèi)醫(yī)發(fā),200210,號,),2010,年,:,醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法,（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā),【2010】194,號）,醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室工作導(dǎo)則,（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā),【2010】194,號）,截止到,2014,年,1,月，全國按照所制定的標(biāo)準(zhǔn)通過驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室共,2670,余家。采用所編寫的培訓(xùn)教材和培訓(xùn)模式共舉辦了培訓(xùn)班,280,多期，培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員,21000,多人。涉及全國,28,個省、直轄市和自治區(qū)。,目前國內(nèi)臨床分子診斷現(xiàn)狀,絕大部分用于病原體核酸檢測,較少部分用于遺傳病的產(chǎn)前診斷,個體化用藥的分子診斷正在興起,一些常見的認(rèn)識誤區(qū),臨床實(shí)驗(yàn)室,=,檢驗(yàn)科,基因（遺傳攜帶、突變等）與病原體核酸檢測,完全不同,臨床,PCR,檢驗(yàn)在,病理科,、,藥劑科,或,腫瘤科,做，不屬于臨床檢驗(yàn)管理？,必須達(dá)成一點(diǎn)共識：實(shí)驗(yàn)不管在哪做，都屬于檢驗(yàn)管理，必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制。,問題與思考,問題：,應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)室分區(qū),質(zhì)量管理：分析前，分析中，分析后,人員,：（醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員）：均需,“,洗腦,”,嚴(yán)格的培訓(xùn),出現(xiàn)問題，即分析問題產(chǎn)生的原因，采取措施加以改進(jìn),質(zhì)理管理的習(xí)慣養(yǎng)成需要時間。,幾個策略比較,家族病史研究與基因研究相比較,說法不一，孰優(yōu)孰劣？各有所長。,腫瘤早期診斷帶來的真正收益有沒有我們所希望的那么大？,WHO has developed three principles for cancer issues,Current prevention strategies could block up to one-third of all new cancer,Improved early sreening could result in the detection of one-third of cancer at an early stage,。,A comprehensive treatment could improve survial aquality another one-third of pattients with cancer,國家自然科學(xué)基金委醫(yī)學(xué)部主任、國家肝癌科學(xué)中心主任,王紅陽院士，,中國腫瘤治療現(xiàn)狀,治愈率,130mg/dl,、,HCV RNA600000U/ml,預(yù)期治愈率可能大于,80%,個性化檢測的局限性,一些疾病是由一個或多個基因突變引起,基因檢測方法確實(shí)能對這些疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)、確診和治療起指導(dǎo)作用,大多數(shù)疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后可能涉及更多的基因以及這些基因和環(huán)境因素相互作用,僅通過基因檢測盒基因表達(dá)譜的檢測有很大局限性,CLIA,：分子檢測有關(guān)的主要質(zhì)控要求,對于每一個檢測系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室由此又控制程序的責(zé)任,監(jiān)控整個分析過程的準(zhǔn)確性和精密度。,(42 CFR 493.1256,（,A,）,),控制程序必須是：,o,檢出即時誤差,由檢測系統(tǒng)故障、不利于環(huán)境和操作者能力導(dǎo)致,(42 CFR 493.1256,（,C,）（,1,）,),o,監(jiān)控檢測性能的準(zhǔn)確性和精密度,檢測系統(tǒng)能和環(huán)境的改變以及操作者的能力都可能會影響檢測性能。,實(shí)驗(yàn)室必須確定使用檢測物質(zhì)的數(shù)量、類型和頻率，如果適用，由實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證或建立性能規(guī)范,(42 CFR 493.1256,（,b,）,),如果實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了未經(jīng),FDA,認(rèn)可或批準(zhǔn)的檢測系統(tǒng),包括自主研制的方法,在報(bào)告病人檢測據(jù)結(jié)果前，必須建立檢測系統(tǒng)的性能規(guī)范，如果適用，包括下面的性能特征：,o,準(zhǔn)確性，,o,精密度，,o,分析靈敏性，,o,分析特異性，包括干擾物質(zhì)。檢測系統(tǒng)對檢測結(jié)果的可報(bào)告區(qū)間，,o,參考區(qū)間（正常值），和,o,檢測性能要求的其他性能特征。,(42 CFR 493.1253,（,b,）（,2,）,),包括提取過程中的檢測系統(tǒng)包括兩種質(zhì)控物質(zhì)，其中之一可以檢出提取過程的錯誤。,(42 CFR 493.1256,（,d,）（,3,）（,iv,）,),每一擴(kuò)增過程，包括兩種質(zhì)控材料，如果反應(yīng)的抑制是假陰性結(jié)果的重要來源一個質(zhì)控材料能夠檢出該抑制作用。,(42 CFR 493.1256,（,d,）（,3,）（,v,）,),國際相關(guān)機(jī)構(gòu)的,PT,計(jì)劃,CAP,美國病理家協(xié)會,CDC,美國疾病預(yù)防控制中心（基因檢測質(zhì)量控制物計(jì)劃,GTQC,）,QCMD,分子診斷的質(zhì)量控制,EMQN,歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控網(wǎng),ENVID,歐洲重要病毒性疾病診斷網(wǎng),EQAP,西班牙室間質(zhì)評計(jì)劃,EQUAL,歐盟質(zhì)量控制一致行動（現(xiàn)在被稱作分子診斷的質(zhì)量控制,QCMD,）,INQAT,意大利腫瘤標(biāo)志物質(zhì)量保證網(wǎng),NEQAS,英國國家質(zhì)量保證計(jì)劃,臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制（一）,實(shí)驗(yàn)室各種常規(guī)工作的規(guī)章制度,實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的生物安全制度和保護(hù)措施,防止實(shí)驗(yàn)室,PCR,交叉污染的實(shí)驗(yàn)（每月一次）,實(shí)驗(yàn)室的清潔和消毒制度（每周,4-5,次）,實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù)、報(bào)告單的歸檔和信息保密制度,實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員的培訓(xùn)和考核制度,實(shí)驗(yàn)室結(jié)果差錯的記錄和糾正措施,計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)維護(hù)和管理制度,臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制（二）,樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)：抗凝劑，采集時間,/,量，病史。,接收標(biāo)本必須有專用的登記表，并核對樣本登記表中的所有信息，,2,人復(fù)核和簽字。,每批樣本核酸提取的過程中加入質(zhì)控標(biāo)本以保證標(biāo)本處理的過程中的正確性，同時建立用于不同技術(shù)平臺的標(biāo)準(zhǔn)化的,DNA/RNA,濃度范圍。,定量,PCR,檢測的操作過程包括,4,個不同濃度的對照物，以及陰性和陽性對照。,樣本的保存和存儲（,4,和,-80,冰箱）,臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制（三）,室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本的來源：包括參加國內(nèi)和國際質(zhì)控標(biāo)本，細(xì)胞株和已知實(shí)驗(yàn)結(jié)果的樣本。,在每批實(shí)驗(yàn)中和每個技術(shù)平臺上均加入了質(zhì)控樣本，從樣本抽提，基因擴(kuò)增，雜交和測序已知跟蹤到整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后有專門的質(zhì)控報(bào)告。,實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員每一個月，在每一個技術(shù)平臺上都有一次盲樣樣本的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，并以此評價(jià)技術(shù)人員的實(shí)驗(yàn)技能。,分析的有效性,準(zhǔn)確性,o,與參考方法比較,o,設(shè)定,CUT-OFF,值的方法,精密度,/,再現(xiàn)性,o,重復(fù)性：利用分子檢測方法和同一個儀器對單個樣本進(jìn)行重復(fù)性研究。,o,再現(xiàn)性：再現(xiàn)性研究評估天與天、操作與操作間的精密度、如果使用多個儀器，要評估儀器與儀器之間的再現(xiàn)性；如果在多個實(shí)驗(yàn)室開展檢測，也要評估不同實(shí)驗(yàn)室間的再現(xiàn)性。,O,靠近臨床,cut-point,和整個分析檢測區(qū)間內(nèi)的性能,分析的線性、回收率和高劑量鉤子效應(yīng),檢出限值和定量限值（在高和低的范圍內(nèi)）,分析特異性（交叉反應(yīng)，干擾）,基質(zhì)效應(yīng),影響分析結(jié)果的分析前因素,分析輸出（讀數(shù)區(qū)間或陰陽性）,臨床有效性和臨床有用性,臨床有效性：檢測特性（敏感性、特異性、預(yù)測值和擬然比）,臨床有用性：利用檢測結(jié)果可以獲得有效治療或其他具體的臨床獲益,篩選有癥狀個體的檢測：基因,LRRK2-G2019S,突變帕金森癥。,用于診斷和監(jiān)控的檢測：,Heptimax-,由,Quest Diagnostics,研制的實(shí)驗(yàn)室自制檢測。該檢測用于確認(rèn)活動性丙肝病毒（,HCV,）感染、監(jiān)控,HCV,治療反應(yīng)和確認(rèn)感染的消退。,確定預(yù)后和指導(dǎo)治療的檢測：,OncotypeDX,利用實(shí)時熒光定量,PCR,檢測乳腺癌腫瘤組織樣本中,21,個基因的表達(dá)水平。,調(diào)整用藥劑量的檢測：指導(dǎo)華法林劑量的基因檢測,-,基因,CYP2C9,（編碼細(xì)胞色素,P4502c9,）和,VKORC1,（編碼維生素,K,環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物亞單位,1,）的多態(tài)性。,病理說明：,1.,包括“尸體病理學(xué)診斷”、“細(xì)胞病理學(xué)檢查與診斷”、“組織病理學(xué)檢查與診斷”、“分子病理學(xué)技術(shù)與診斷”、“特染和免疫組織化學(xué)染色與診斷”、“電子顯微鏡技術(shù)與診斷”和“其他”項(xiàng)目七個部分，共計(jì),53,項(xiàng)。,檢驗(yàn)說明：,1.,包括“臨床血液學(xué)檢驗(yàn)”、“臨床體液檢驗(yàn)”、“臨床化學(xué)檢驗(yàn)”、“臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)”、“臨床微生物與寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)”和“臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)”項(xiàng)目六個部分，共計(jì),1104,項(xiàng)。,2.,組織器官移植所需的各項(xiàng)檢驗(yàn)（如,HLA,檢查等）列入“臨床血液學(xué)檢驗(yàn)”類的“血型、輸血及人類組織相關(guān)性抗原檢驗(yàn)”類中。,3.”,實(shí)驗(yàn)室診斷,”,中的項(xiàng)目不含靜脈采血，需單獨(dú)收費(fèi)，但微量采血管（指尖采血、耳垂采血）包含在各檢驗(yàn)項(xiàng)目中，不得單獨(dú)收費(fèi)。,（四）分子病理學(xué)技術(shù)與診斷,BDAA0001,組織部,/,細(xì)胞原位雜交檢查診斷,石蠟包埋組織，新鮮冷凍組織，細(xì)胞涂片，組織切片機(jī)切片，進(jìn)行二甲苯脫蠟，系列乙醇水化，微波爐、高壓鍋及蛋白酶處理，標(biāo)記探針雜交反應(yīng)，洗滌，酶或親和物結(jié)合反應(yīng)，顯色，判讀結(jié)果，含上述過程中所產(chǎn)生的廢液、廢物的處理。,BDAB0001,組織部,/,細(xì)胞熒光原位雜交檢查診斷,熒光素標(biāo)記探針雜交反應(yīng)（一種探針）。,BDAB0002,組織部,/,細(xì)胞多色熒光原位雜交檢查診斷,熒光素標(biāo)記探針雜交反應(yīng)（二種或以上探針）,.,BDAB0003,組織部,/,細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)計(jì)量分析診斷,熒光素標(biāo)記探針雜交反應(yīng)（二種或以上探針），圖像定量分析。,BDAC0001,組織部,/,細(xì)胞原位脫氧核糖核酸（,DNA,）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢查診斷,原位,PCR,反應(yīng)，親和物結(jié)合，顯色，復(fù)染，觀察，診斷。,BDAD0001,組織部,/,細(xì)胞原位核糖核酸（,RNA,）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢查診斷,原位逆轉(zhuǎn)錄,PCR,反應(yīng)，親和物結(jié)合，顯色，復(fù)染，觀察，診斷。,BDAE0001,組織部,/,細(xì)胞熒光定量脫氧核糖核酸（,DNA,）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢查診斷,甲醛固定組織，石蠟包埋組織，新鮮或冷凍組織，離心收集細(xì)胞；組織粉萃機(jī)勻漿化，組織裂解，經(jīng)反復(fù)離心及相應(yīng)化學(xué)試劑去除蛋白，回收,DNA,，于熒光,PCR,儀進(jìn)行熒光素,PCR,反應(yīng)，分析結(jié)果，診斷。,BDAF0001,組織部,/,細(xì)胞熒光定量核糖核酸（,RNA,）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢查診斷,回收,RNA,，于于熒光,PCR,儀進(jìn)行熒光素逆轉(zhuǎn)錄,-PCR,反應(yīng)，分析結(jié)果，診斷。,BDAG0001,腫瘤組織脫氧核糖核酸（,DNA,）測序,PCR,反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，產(chǎn)物純化，測序反應(yīng)，于,DNA,測序儀分析，觀察結(jié)果，診斷。甲醛固定組織，,石蠟包埋組織，新鮮或冷凍組織，血液或體液的處理，,DNA,提取，,PCR,反應(yīng)及最后的測序反應(yīng)純化。,臨床分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn),CLAY8000 HIV-,核糖核酸擴(kuò)增定量檢測,CLAZ8000 HIV-,核糖核酸非擴(kuò)增定性檢測,CLBA8000,分枝桿菌菌種鑒定,CLBB8000,結(jié)核,/,非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測,CLBC8000,巨細(xì)胞病毒脫氧核糖核酸擴(kuò)增定性檢測,CLBD8000,巨細(xì)胞病毒脫氧核糖核酸擴(kuò)增定量