,*,主講教師：肖 小 華,微波輔助提取-高效液相色譜法,測(cè)定蔬果中的維生素C含量,實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：5 學(xué)時(shí),實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：,實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nèi)容及要求,高效液相色譜簡(jiǎn)介,HPLC的使用與維護(hù),H,igh,P,erformance,L,iquid,C,hromatography,一、高效液相色譜法,歷史回憶；,根本原理與概念；,HPLC定性與定量方法；,HPLC儀器組成。,一、歷史回憶,色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特別離植物色素時(shí)采用；,40年代，TLC，紙色譜，柱層析；,50年代，GC出現(xiàn)使色譜具備別離和在線分析功能；,60年代末 HPLC出現(xiàn)，使色譜分析范圍進(jìn)一步擴(kuò)大；,1新型固定相和檢測(cè)器,2聯(lián)用儀器：GC-MS，HPLC-MS,3智能化開(kāi)展,1937-1972,年，,35,年中有,12,個(gè),Nobel,獎(jiǎng)是與色譜研究相關(guān)的！,固定相,CaCO,3,顆粒,流動(dòng)相,石油醚,色帶,色譜Chromatography一詞來(lái)源于希臘語(yǔ)中“chroma=color;“graphein=write,二、根本原理,當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)屢次的分配平衡，各組分被固定相保存的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。,與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的別離與檢測(cè)；,兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的根底。,色譜法分類(lèi),1,按兩相分子的聚集狀態(tài),分：,氣體 固體 氣-固色譜,氣體 液體 氣-液色譜,氣相色譜,液相色譜,液體 固體 液-固色譜,液體 液體 液-液色譜,2按,固定相的固定方式,分：,平面色譜,紙色譜,薄層色譜,高分子薄膜色譜,柱色譜,填充柱色譜,毛細(xì)管柱色譜,3按別離機(jī)制分：,分配色譜,：利用分配系數(shù)的不同,吸附色譜,：利用物理吸附性能的差異,離子交換色譜,：利用離子交換原理,空間排阻色譜,：利用排阻作用力的不同,優(yōu)點(diǎn)：“三高、“一快、“一廣,缺點(diǎn)：,高,選擇性可將性質(zhì)相似的組分分開(kāi),高效能反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異,產(chǎn)生很好分離效果,高,靈敏度10,-11,-10,-13,g，適于痕量分析,分析速度,快,1 min-1 hr;一次可以測(cè)多種樣品,應(yīng)用范圍,廣,氣體，液體、固體物質(zhì)化學(xué)衍生化再色譜分離、分析,對(duì)未知物分析的定性專(zhuān)屬性差,需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS),一些根本概念,1.,分配系數(shù),(,partition factor,),K,組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過(guò)程叫做分配過(guò)程。在一定溫度下，組分在兩相間分配到達(dá)平衡時(shí)的濃度比，稱(chēng)為分配系數(shù)，用K 表示，即：,分配系數(shù)是色譜別離的依據(jù)。,2.,分配比,(,partition radio,),k,是指在一定溫度下，組分在兩相間分配到達(dá)平衡時(shí)的質(zhì)量比。在實(shí)際工作中，常用來(lái)表征色譜分配平衡過(guò)程。,1、分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨別離柱溫度、柱壓的改變而變化；,2、分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保存能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保存時(shí)間越長(zhǎng)；,3、分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。,分配比也稱(chēng)：,容量因子(,capacity factor,)或 容量比,容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系,式中為相比。,容量因子越大，保存時(shí)間越長(zhǎng)；,VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；,VS為固定相體積，對(duì)不同類(lèi)型色譜柱，VS的含義不同；,氣-液色譜柱：VS為固定液體積；,氣-固色譜柱：VS為吸附劑外表容量；,分配比與保存時(shí)間的關(guān)系,保存因子(retention factor)：,us：組分在別離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在別離柱內(nèi)的線速度；保存因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示：,假設(shè)組分和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的別離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，那么：,由以上各式，可得：,t,R,=,t,M,(1+,k,),3.色譜流出曲線色譜圖,混合組分的別離過(guò)程及檢測(cè)器對(duì)各組份在不同階段的響應(yīng),關(guān)于色譜圖的幾個(gè)根本術(shù)語(yǔ),1、基線,無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。,2、保存值,保存時(shí)間tR：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；,死時(shí)間tM：不與固定相作用的氣體或液體的保存時(shí)間；,調(diào)整保存時(shí)間(tR)：tR=tRtM,也可用體積表示，對(duì)應(yīng)為保存體積、死體積和調(diào)整保存體積,3、相對(duì)保存值r21,組分2與組分1調(diào)整保存值之比：,r21=tR2 /tR1=VR2/VR1,相對(duì)保存值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無(wú)關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。,色譜流出曲線的意義：,色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)；,色譜保存值定性依據(jù)；,色譜峰高或面積定量依據(jù)；,色譜保存值或區(qū)域?qū)挾壬V柱別離效能評(píng)價(jià)指標(biāo)；,色譜峰間距固定相或流動(dòng)相選擇是否適宜的依據(jù)。,4、區(qū)域?qū)挾?用來(lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：,1標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。,2半峰寬(W1/2)：色譜峰高一半處的寬度 W1/2=2.354,3峰底寬(Wb)：Wb=4,5.別離度(Resolution,R),同時(shí)反映色譜柱效能和選擇性的一個(gè)綜合指標(biāo)。也稱(chēng)總別離效能指標(biāo)或分辨率。其定義為：,利用此式，可直接從色譜流出曲線上求出別離度R。,R=1.5,R=0.75,R=1.0,響應(yīng)信號(hào),保留時(shí)間,t,min,R 越大，相鄰組分別離越好。當(dāng)R=1.5時(shí)，別離程度可達(dá)99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開(kāi)的判據(jù)。,三、HPLC定性與定量,1、定性方法,a、保存時(shí)間,b、與結(jié)構(gòu)表征的檢測(cè)器聯(lián)用,2、定量方法,a、峰高與峰面積,b、外標(biāo)法,c、內(nèi)標(biāo)法,四、HPLC儀器組成,早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑15cm,長(zhǎng)50500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150200 m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(1 mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！,當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度H min也相應(yīng)增加了！或者說(shuō)柱效下降了。,為了解決分析時(shí)間及柱效問(wèn)題，最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑310 m！,粒徑減小，液體流過(guò)所需壓力增大-高壓裝置,分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，這些物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類(lèi)物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。,流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的時(shí)機(jī)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)別離的奉獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)別離。,操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。,HPLC與GC的比較,1.儀器結(jié)構(gòu),HPLC儀器包括：,高壓輸液裝置;,進(jìn)樣系統(tǒng);,別離系統(tǒng);,檢測(cè)系統(tǒng);,此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。,2、主要部件,(1)高壓輸液泵,主要部件之一，壓力：150350105 Pa。,為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相BC,正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系,正相色譜和反相色譜出峰順序相反,時(shí)間，min,固定相：C,1,固定相：C,8,固定相：C,18,硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜別離的影響,1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯,可見(jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，別離效果越好。,b)流動(dòng)相,按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；,按極性分：極性、弱極性、非極性；,按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。,常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。,采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)別離或調(diào)整出峰時(shí)間。,在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。,采用正相液-液分配別離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，假設(shè)組分的保存時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。,也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保存時(shí)間縮短。,常用溶劑的極性順序：,水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題,1盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。,2防止流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,3試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。,4流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。,溶劑(流動(dòng)相)組成對(duì)色譜別離的影響,1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌；4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；,70%CH,3,OH,+30H,2,O,60%CH,3,OH,+40H,2,O,50%CH,3,OH,+50H,2,O,40%CH,3,OH,+60H,2,O,由于分析物組成復(fù)雜，以某一組成的流動(dòng)相可能使局部待測(cè)物得到好的別離，但同時(shí)出使其它待測(cè)物的別離不令人滿意！實(shí)際工作中采用程序升溫GC和梯度淋洗LC來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。,色譜別離中的問(wèn)題-梯度洗脫,2-簡(jiǎn)單維護(hù),1、為什么溶劑和樣品要過(guò)濾?,溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。,色譜柱,：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。,儀器,：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。,樣品過(guò)濾頭,的類(lèi)型：30 mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，材料有纖維素,醋酸纖維，聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。13 mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，材料為纖維素。3 mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，處理樣品體積為7l。,濾膜類(lèi)型,：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑；適用于水溶液。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。,2、流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體如O2，防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的別離性能。假設(shè)用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法有：氦氣脫氣法：利用氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但本錢(qián)高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相用超聲波振蕩10-15 min，此法效果最差。在線真空脫氣法：利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，本錢(qián)低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。,3、如何防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞及堵塞后的處理 溶劑的污染以及藻類(lèi)的生長(zhǎng)會(huì)堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液pH=4-7。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞。A：嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過(guò)濾。B：勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液 C：如果應(yīng)用許可，可在溶劑中參加的疊氮化鈉.D:在溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣，隔絕空氣。E：防止使溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過(guò)濾頭從組件中取下，在硝酸10%-35%中浸泡1 h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。,三、高效液相色譜實(shí)驗(yàn)